生物安全三级实验室(bio-safety levelⅢlaboratories, BSL-3)是按照国家标准 (GB19489-2004)“实验室生物安全通用要求”[1]中的BSL-3防护标准建立的实验室, 是专门针对通过气溶胶传播, 可导致严重后果或生命的内源性和外源性病原而特设的适用于临床、诊断、教学和研究的设置[2]。
原卫生部关于“省、地、县级疾病预防控制中心实验室建设指导意见” (卫办疾控发[2004]108号) 中明确要求, 省级疾控中心必须建设BSL-3[3]。辽宁省疾控中心按照国家标准要求进行了BSL-3的设计施工, 经国家建筑工程质量监督检验中心按国家标准 (GB50346-2004) “生物安全实验室建筑技术规范”[4]的BSL-3相关技术指标进行全面检测, 各项指标均符合规范的要求。随着新版国家标准 (GB19489-2008) “实验室生物安全通用要求”[5]的实施, 导致原有实验室因未达到新标准的要求而无法使用。新版的通用要求对生物安全实验室提出了更高要求, 必须进行升级改造, 使实验室能够满足新标准要求。
新版国家标准的解读
新标准提出了实验室防护区概念, 更加明确了生物安全实验室污染风险较大的区域, 明晰了污染区和清洁区域的区分和隔离, 在实验室设计及流程规划方面, 具有重要的指导意义。其中BSL-3是新版“实验室生物安全通用要求”的主要内容, 是修订后差异最大的一类实验室。
1.1 细化BSL-3的分类
根据生物安全实验室建设和管理的原则, 以病原传播特性和实验室所采用的安全隔离设施为基础, 明确了从操作人类免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV) 等非经空气传播致病性生物因子的实验室, 到操作禽流感病毒等经空气传播致病性生物因子的实验室的要求。在不降低安全水平的同时, 使国家标准的适用性更广泛, 利于节约资源和科学管理实验室。
1.2 BSL-3分区与国际接轨
新版国家标准明确了实验室防护区的概念。“防护区”概念是基于风险评估的宏观控制理念, 利于实验室根据需求建设适用的实验室。引入防护区的概念, 并不影响实验室现有的分区方法, 且使国家标准与国际标准互通性更强, 利于国际合作与交流, 符合国家标准的制定原则。
1.3 定义实验室严密性和其他控制参数
新版国家标准定义了实验室严密性和其他控制参数数值范围, 明确了采用烟雾测试、空气泄漏率检测法或压力衰减法检查实验室防护区内围护结构严密性的适用条件, 并将检测方法作为标准的资料性附录。
1.4 实验室内的送排风方式
新版国家标准引入国际成熟经验和做法, 不具体限制房间的送排风方式。标准强调气溶胶概念, 在实验工作中尽可能减少产生气溶胶的操作, 所有可能产生气溶胶的实验操作应在生物安全柜内进行, 同时在通风系统设计中, 对实验室内的气流采取流向控制的手段, 保持室内的空气定向流动, 避免产生乱流。
1.5 过滤器单元的属性和功能
新版国家标准提出排风系统高效微粒空气过滤器 (high efficiency particulate air filter, HEPA) 单元的具体属性和功能, 保证过滤器的有效性, 明确要求可以原位消毒和检漏, 并将公认的扫描检漏方法作为标准的资料性附录。
BSL-3改造关键技术
通过开展BSL-3的安全风险评估, 按照2008版规范条文要求主要对通风系统和通讯系统进行改造。
2.1 通风系统技术改造措施
新版国家标准要求“HEPA过滤器的安装位置应尽可能靠近送风管道在实验室内的送风口端和排风管道在实验室内的排风口端”。
对于生物安全实验室而言, 安全为第一位。在实验室改造时必须理解和考虑本标准要求的所有与生物安全相关的设计原则, 并经过风险评估[6]。安全的核心措施是排风保负压, 保证周围环境不受污染, 排风系统的HEPA是保证实验操作过程中感染性气溶胶不外泄的最后防线, 应尽可能缩短与实验室之间管道的长度, 以减少污染区域, 保证此段管道消毒的效果, 确保管道的气密性和消毒效果, 并应给予验证。
2.1.1 技术改造措施
(1) 在防护区的两个核心工作间内各自安装了2台HEPA过滤器, 安装位置在核心区的墙壁上距地30 cm, 在保证总排风量和负压值的前提下, 实现了到室内排风口的最短距离。
(2) “应可以在原位对排风HEPA进行消毒灭菌和检漏”。新标准中加强并落实对排风HEPA进行原位消毒灭菌和检漏的要求。HEPA是生物安全实验室的最重要的二级防护屏障, 阻止实验室空气中的有害粒子进入外部环境中, 其表面可能存留了高致病性病原微生物, 其完整性须得到保证。应根据实验室的情况, 定期对HEPA过滤器检漏。此外, 检漏、维护或更换HEPA过滤器时, 应先消毒灭菌, 避免感染人和污染环境。改造措施关键设备HEPA采用国际最先进的产品, 且具备扫描验证功能的CamSafe 3型高效过滤送排风设备 (美国Camfil公司) , 其本身带有原位捡漏的机械装置、采样头和测量过滤器阻力变化的压力表。
(3) 在改造该实验室时, 重点考虑了HEPA过滤器的安装方式, 以利于定期在原位对排风HEPA进行消毒灭菌和检漏。排风HEPA安装在核心工作间墙壁的下方, 工作人员更换防护服后进入核心区, 可以方便地对HEPA过滤器进行液体喷雾消毒, 并用检测仪器连接HEPA的专用接口进行原位捡漏扫描。
(4) 国内对HEPA消毒灭菌的方法通常包括气体熏蒸和液体喷雾的方式, 气体熏蒸包括局部循环方式[7,8]。由于气体无孔不入, 而可同时消毒管道、容易进行消毒效果验证, 是必然发展趋势。针对液体喷雾消毒, 仍缺乏相应的研究数据, 如标准操作程序、消毒的范围、适用的微生物及验证方法等, 因此采用局部气体循环消毒HEPA如图1所示。
▲图1 局部气体循环消毒HEPA方法示意图
(5) 对HEPA过滤器消毒灭菌的效果与微生物在环境中的稳定性、BSL-3实验室的类型有关, 某些微生物在环境中的生存能力极低, 芽孢则反之;在正常工作时, 其HEPA过滤器的污染程度会较高;实验室在设计消毒方案时应充分评估和确认, 考虑多种因素, 以达到安全、经济适用、避免引入新风险的目的。实验室宜首先确定消毒方法, 可采用过氧化氢、二氧化氯及甲醛熏蒸等方法, 再根据设施和消毒设备的特点由专业人员设计消毒方案, 通过试运行验证消毒效果[9,10]。
2.1.2 HEPA检漏方法
(1) 扫描检漏或全效率检漏法是目前国际上通用的方法。扫描检漏法通过采样头在靠近过滤器出风面的位置沿过滤器的所有表面及过滤器与装置的连接处以固定速度移动, 测试局部过滤效率, 判断过滤器是否发生泄漏。全效率检漏法通过测试过滤器的总过滤效率判断过滤器是否发生泄漏。全效率检漏法需在被测过滤器出风面之后设置混流段, 以使气溶胶在风道截面上均匀分布, 下游采样口应选择在混合较好的区域。全效率检漏法一般用于无法接近HEPA过滤器的高效空气过滤装置检漏, 精度较扫描检漏法低[11]。HEPA上某点的局部效率低于给定限值或HEPA过滤器的总效率低于99.97%即为过滤器泄漏。
(2) 对HEPA进行检漏的关键因素之一是选择适宜的示踪粒子, 所发生气溶胶的粒子直径为0.3 m, 浓度和粒径要分布均匀和稳定, 应优先选用对人和环境无害、不易造成实验室污染的物质, 目前可用的包括癸二酸二异辛酯[Di (2-ethylhexyl) sebacate, DEHS]、邻苯二甲酸二辛酯 (dioctyl phthalate, DOP) 或聚α烯烃 (Polyaphaolefin, PAO) 等。
(3) 新标准推荐了对HEPA检漏的公认方法。生物安全实验室的HEPA过滤器主要用于捕集携带生物因子的微粒。目前, HEPA过滤器的捕集能力 (效率) 主要是针对粒子大小而言, 与是否是化学粒子或生物粒子无关。作为示踪物, 生物粒子的劣势为: (1) 粒子直径通常在数微米 (μm) , 不符合过滤器检漏的公认方法定义的要求; (2) 其需要培养, 检测周期长且难以避免部分细菌培养不出来, 出现假阴性结果; (3) 造成实验室生物性污染。
2.1.3 生物型密闭阀的安装
(1) “应在实验室防护区送风和排风管道的关键节点安装生物型密闭阀, 必要时, 可完全关闭。应在实验室送风和排风总管道的关键节点安装生物型密闭阀, 必要时, 可完全关闭”。该条款具有生物型密闭阀和关键节点的两个要点。
(2) 生物型密闭阀, 送、排风管道密闭阀的生物安全作用是当出现事故、消毒及停运期间等现象时, 实现与外环境之间的隔离, 防止感染型气溶胶外泄, 作为区域划分中物理隔离的装置, 可以防止气体在不同区域间的流动。密闭阀应视为其所在部位结构完整性的一部分, 密闭性能要符合其所隔离部位的要求, 其主要发挥保证生物安全的作用, BSL-3改造采用的生物型密闭阀应满足: (1) 密封性符合其所在部位的要求、耐腐蚀、耐老化和耐磨损; (2) 关断时间符合不同工况的要求;
(3) “关键节点”与实验室的复杂程度和送排风设计方案直接相关[12]。通过对整个实验室运行风险的评估, 确定防护区中的核心工作区是污染概率最大的区域, 应在实验室核心工作区靠近围护结构处的送风和排风干管上安装生物型密闭阀, 以满足核心工作间紧急故障状态和气体熏蒸消毒状态的要求;也要在防护区和辅助工作区之间分隔处的送风和排风干管上安装生物型密闭阀, 在必要时实现防护区与其他区域之间的隔离。改造工程的15个密闭阀已经安装在送风支路节点和排风支路节点上, 借助自控及硬件连锁手段, 可以在工况需要切换时自动关闭。
2.1.4 监测HEPA过滤器的阻力
(1) “应设装置连续监测送排风系统HEPA过滤器的阻力, 需要时, 及时更换HEPA过滤器”;“应在有负压控制要求的房间入口的显著位置, 安装显示房间负压状况的压力显示装置和控制区间提示”。HEPA过滤器是高级别生物安全实验室最重要的二级防护设备, 阻止有害生物因子进入环境, 必须保证其性能正常。通过连续监测送排风系统HEPA过滤器的阻力, 可实时观察HEPA过滤器阻力的变化情况, 便于及时更换HEPA过滤器。当过滤器的阻力显著下降时, 应考虑HEPA过滤器破损的可能。对于实验室改造重点需要考虑的是阻力监测方案, 因为每个实验室HEPA过滤器的安装方案不同。
(2) 有负压控制要求的防护区内各个房间入口的显著位置, 安装物理压力显示装置, 是指针式压差计, 既直观又可靠, 目的是使人员在进入房间前再次确认房间之间的压差情况, 做好思想准备和执行相应的方案。应注意的是, 此处监测房间之间的相对压差。
(3) 有负压控制要求的防护区内各个房间排风高效过滤器端, 安装压力传感器装置, 通过线路接入控制系统的核心可编程逻辑控制器, 并可以将数据传输到控制电脑, 由控制电脑显示并存储采集的压力值, 目的是使操作人员在进入房间前了解过滤器阻力压差变化情况, 做好更换过滤器的准备, 应注意监测过滤器前后端的压差。
2.2 通讯系统技术改造措施
(1) 新版国家标准要求, “需要时, 应可立即解除实验室门的互锁;应在互锁门的附近设置紧急手动解除互锁开关”。核心工作间附属的缓冲间, 具有双门互锁功能以保障核心工作间的压力梯度及感染型气溶胶的外泄, 但是该装置不利于紧急撤离时的逃生。通讯及弱电系统改造时按新标准规定, 增加实验室门的互锁解除的解除按钮, 以便在需要时人员可立即逃出。实验室互锁的门会影响人员的通过速度, 应有解除互锁的控制机制。当出现紧急状态时, 监控室工作人员通过通讯系统中的对讲机告知核心工作间人员需要紧急撤离, 并通过中控系统解除所有门或指定门的互锁[13]。同时, 撤退人员也可以手动解除设在每扇互锁门附近的紧急手动解除互锁开关, 安全撤离。
(2) “核心工作间的缓冲间的入口处应有指示核心工作间工作状态的装置 (如文字显示或指示灯) , 必要时, 应同时设置限制进入核心工作间的连锁机制”。按规定, 在BSL-3核心工作间的缓冲间的入口处, 安装工作状态显示装置, 其目的是防止人员意外或随意进入核心工作间。在实验进行中或发生溢洒事故时, 不允许人员随意进出房间。基于此, 在实验室改造过程中, 缓冲间的入口处应有表明核心工作间内部状态的显示, 如红灯、绿灯、黄灯3组, 提示其他人员暂时不要进入核心工作间。必要时应在核心工作间内部锁住缓冲间对外的门, 限制人员进入。
2.3 通讯及弱电系统的技术改造
(1) 新版国家标准要求, “实验室防护区内应设置向外部传输资料和数据的传真机或其他电子设备;监控室和实验室内应安装语音通讯系统。如果安装对讲系统, 宜采用向内通话受控、向外通话非受控的选择性通话方式;通讯系统的复杂性应与实验室的规模和复杂程度相适应”。该条款是关于BSL-3通讯系统的要求。实验室通讯系统的形式包括语音通讯、视频通讯和数据通讯等, 均在网络综合布线系统的基础上完成, 传输的基带信号为数字信号, 目的主要有两个, 安全方面的信息交流和实验室数据传输, 包括语言、文字、图像和数据。在实验室运行期间, 监控室内要有工作人员值守。
(2) 为避免污染扩散的风险, 在实验室防护区内 (通常为核心工作间) 设置的传真机或计算机网络系统, 将实验数据、实验报告、数码照片等资料和数据向实验室外传递。在BSL-3实验室内从事的高致病性病原微生物相关的实验活动, 是一项复杂、精细、高风险和高压力的活动, 需要工作人员高度集中精神, 始终处于紧张状态。为尽量减少外部因素对实验室内工作人员的影响, 监控室内的通话器宜为开关式。在实验间内采用免接触式通话器, 使实验操作人员随时可方便地与监控室人员通话。
(3) 适用的通讯设备设施包括电话、传真机、对讲机、选择性通话系统、计算机网络系统、视频系统等等, 根据实验室的规模和复杂程度选配, 已经合理的设置通讯点的位置及数量。保证了实验室通讯的畅通, 并符合实验室安全性的要求。目前在两个核心工作间、缓冲间、准备间、一更衣间、二更衣间均安装电话, 在核心工作间安装了对讲机、传真机和网络接口。在实验室改造过程中, 应用了第四代通讯技术4G网络, 安装了短信收发器, 内置移动的SIM卡, 可将设施运行过程中发生的报警和故障信息发给指定人员, 便于及时了解和快速处置。
BSL-3改造后检测效果
根据对新标准制定了BSL-3的详细整改方案, 该方案经国家认可委员会的资深专家论证后给予充分肯定, 并提出补充建议, 确认最终的改造方案。
BSL-3改造方案确认后, 经过正规的招投标程序。由专业施工单位按该方案进行改造, 改造工程完成后, 再次通过国家建筑工程质量监督检验中心按国家标准GB50346-2011“生物安全实验室建筑技术规范”[14]中的BSL-3要求的标准进行了全面检测, 各项技术指标均达到要求。改造后的实验室已通过国家认可委员会的BSL-3认可。
结论
根据国家新标准要求, BSL-3内的排风装置应该尽量靠近排风口端, 在现场条件许可的情况下设计成顶送风顶排风, 保证室内定向气流, 可减少一段排风管道, 并且对排风过滤单元的维护可以放在设备层进行。
在BSL-3中, 紧急手动解除互锁开关装置是整个核心实验室内人员安全保证措施, 但是在正常化使用时, 对人员的操作应该有明确要求, 严格避免误操作和误碰触, 保证核心实验室的整体安全性。
高效过滤器已经设立连续的监测装置, 但最终阻力多大时应更换高效过滤器, 只能在实际应用中逐步摸索, 并与整个实验室的运行工况相结合。若实验室在使用状态中, 则应推迟更换高效过滤器, 待到实验结束消毒后方能进行更换, 高效过滤器的更换应统一进行, 更换前后须统一消毒。
BSL-3的设施及设备应有专业的供应商负责维护, 每次使用前或使用中应根据监控指标确认设施设备的性能处于正常工作状态, 并记录。设施设备维护、修理、报废或被移出实验室前应先清洁和消毒灭菌;同时要求维护人员穿戴适当的防护装备, 充分的保护人员、环境的安全。
