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Fluidigm 公司开发了一种在C1TM单细胞自动制备系统及BiomarkTM HD系统上检测单细胞miRNA表达谱的实验方案。此方案可以在小于24小时的时间内，平行处理96个单细胞，在一张GE 96.96芯片对每个单细胞分别检测多达96种miRNA。配套的SINGuLAR™ 2.0分析软件可以对数据进行非监督式聚类分析及PCA分析，有效的根据miRNA表达类型在单细胞水平揭示细胞群体的异质性，为研究miRNA调控提供更多数据。
使用自动化的微流控芯片系统在单细胞中检测MicroRNA的异质性
Leyrat Anne, Shuga Joe, Li Nianzhen, Szpankowski Lukasz, Unger Marc & West Jay
（ISSCR 2013 poster: F-3201）
介绍
MicroRNA (miRNAs)是一类短小（18-24个核苷酸）的非编码RNA，它们可以通过破坏信使RNA（mRNA）的稳定性和抑制mRNA翻译来调控基因表达。细胞群体中miRNA的表达通常认为可以驱动下游基因表达和蛋白功能。我们的目的是使用一种微流控系统在单细胞水平确定miRNA表达的变化，这种系统可以自动化的将单细胞捕获及miRNA预扩增以便进行后续表达分析。我们开发了一种简单、模块化的流程，可以将对细胞群体的分析轻松降至单细胞水平（图1）。此流程包括两个核心部件：C1TM单细胞自动制备系统（图1a：样本制备，包括细胞分离和从miRNA制备cDNA）和动态芯片（Dynamic Array™ IFC）及BiomarkTM HD系统（图1b：读出，高度平行的表达分析）。对C1TM芯片捕获的每个单细胞进行的目标特异性扩增（Specific Target Amplification, STA），借用了Single Cell-to-Ct™试剂盒(Life Technologies)完成裂解及预扩增步骤，以及TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription 试剂盒(Life Technologies)完成逆转录步骤（图2）。
使用动态芯片及BiomarkTM HD系统，可以使用96对microRNA TaqMan表达引物，平行分析从96个单细胞预扩增所得的96个cDNA样本。使用Fluidigm SINGuLAR™ 2.0分析软件对数据进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），揭示了从单一表型所得的一群单细胞中miRNA表达的显著变化（图3,4,5）。比较不同表型的细胞群体（人类胚胎成纤维细胞，人类诱导多能干细胞（iPS），从iPS所得人类神经祖细胞（NPC），以及完全分化的人类神经元（HN）），除同一类细胞之间表达的异质性外，展示了(不同类型细胞间)更巨大的差异。
结果
图1. 在单细胞进行miRNA分析的整合流程
C1单细胞自动制备系统使用Life Technologies 开发的试剂和实验方法（“Single-cell MicroRNA expression analysis”），对单细胞中的miRNA转录本进行目标特异性扩增（STA）。从将细胞悬液加至C1芯片到完成数据分析的整个流程，可以在不到24小时内完成。
图2. C1 MicroRNA STA实验流程
单细胞悬液（200-1000个细胞）被加入C1 IFC芯片的细胞进样孔。使用来自Single Cell-to-Ct™试剂盒(Life Technologies)的裂解和预扩增试剂，以及来自TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription 试剂盒(Life Technologies)的逆转录试剂，进行逆转录（使用MegaplexTM RT pool）和预扩增（使用MegaplexTM PreAmp pool)，以便可以检测每个单细胞中多达380种miRNA的表达。C1 IFC捕获单细胞，然后冲洗，裂解，在反应仓平行对每个单细胞的miRNA进行逆转录和预扩增。96个预扩增过的样本然后被导出，使用Biomark HD系统在一块96.96动态芯片运行，研究每个样本中多达96种miRNA的表达。
图3. 分析：单个iPS细胞及其NPC后裔
(A) 对数据进行非监督式聚类分析可以清楚的区别开iPS细胞及使用小分子从iPS获得的NPC后裔1. 同时揭示了每种细胞中的亚群。
(B) PCA清楚的揭示了这两种表型不同的细胞群之间的差异。
(C) Violin Plot显示了不同亚群中miRNA 的差异性表达，以及主成分1和2的主要贡献者（左上至右下的顺序）。iPS和NPC之间5种miRNA的表达变化，和使用microassay从胚胎干细胞（ES）及其NPC后裔得到的趋势相同（未发表数据，Yao Shuyuan友情提供）。
图4. 人类神经元，iPS和NPC细胞
(A) 对从iPS，NPC和成熟神经元（HN）获得的数据进行非监督式聚类分析，可以清楚的将HN细胞从iPS和NPC细胞区分开，同时也揭示了每类细胞中存在的亚群。miR-9更频繁且更高水平的在成熟神经元（HN）中表达。
(B) 根据miRNA表达，PCA可以清楚的区分这三类细胞。miR-20a，19b，17，和106a在HN中表达水平较低，符合基于神经分化和衰老数据的预期2,3。
图5. 不同传代数的胚胎成纤维细胞
(A) 对从两个不同传代数（P13和P24）获得的BJ胚胎成纤维细胞得到的数据进行非监督式聚类分析，虽然可以揭示不同细胞间miRNA表达类型的不同，却无法区分这两种群体。
(B) 对从P13和P24细胞得到的miRNA表达数据进行PCA分析，进一步确认无法根据miRNA表达区分这两群细胞。
(C) 当传代数相距更远（P7 对P24），对miRNA数据（热图未显示）进行PCA分析可以区别他们。
结论
· 我们在C1TM单细胞自动制备系统开发了一种简洁的实验方案，能以最少的手工操作，在不到24小时内，平行处理高达96个单细胞，对其miRNA表达谱进行分析。
· C1 miRNA STA实验方案使用了Life Technologies为miRNA优化过的试剂。特别的，Megaplex™ RT及PreAmp pool可以从C1 IFC上每个单细胞获得多达380种不同miRNA的cDNA。使用Biomark系统，在96.96 GE动态芯片可以读出表达类型。
· 对来自不同类型细胞的数据进行非监督式聚类分析及PCA分析，揭示了不同类型细胞之间、或者同一类型细胞中miRNA表达类型的差异（被microarray或者文献所证实）。
参考文献
1. Chambers SM, et al. (2009) Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27(3), 275-280.
2. Trompeter H-I, Abbad H, Iwaniuk KM, Hafner M, Renwick N, et al. (2011) MicroRNAs MiR-17, MiR-20a, and MiR-106b Act in Concert to Modulate E2F Activity on Cell Cycle Arrest during Neuronal Lineage Differentiation of USSC. PLoS ONE 6(1): e16138. doi:10.1371/journal.pone.0016138
3. Hackl M., Brunner S., Fortschegger M., Laschober G.T., Micutkova L., et al. (2010), miR-17, miR-19b, miR-20a, and miR-106a are down-regulated in human aging. Aging Cell, 9(2), 291-296.
