多功能酶标仪灵敏度的描述及探讨

      现在，多功能酶标仪基本上是每个生物学实验室必备的基础科研设备。市场上多功能酶标仪品牌主要有Bio-Tek、BMG、MD、PE、Tecan等。每个品牌都有自己的特色和优势产品。而各品牌厂家在对自己产品性能－比如说检测灵敏度的描述时，除了表征光吸收值的OD值参数外，像荧光检测灵敏度、发光检测灵敏度等，却往往没有一个统一的方式和定义（名称等）。这对用户在选购酶标仪时进行仪器间性能的对比会带来一定的困惑。我们来看看市场上的优势品牌在对荧光检测灵敏度这一参数的不同的描述：

表1:

       从上表1可看出，对于灵敏度的描述，主要有“Sensitivity”和“Detection Limit”两种说法,我们分别来看它们的定义：
       A: Detection Limit： 检出限，这里有两种理解：分析方法检出限和仪器检出限

       1.分析方法的检出限：国际理论与应用化学联合会（IUPAC）对检出限的规定：对各种光学分析方法，可测量的最小分析信号XL以下式表示：

• XL＝Xb+kSb
• 式中Xb―空白多次测定的平均值（n≥20）
• Sb－空白多次测定的标准偏差
• k－根据一定置信水平确定的系数（IUPAC规定k＝3，此时的置信水平为90%）。为了提高检出限的可靠性，人们还提出了保证检出限（Limit of Guaranteed Detection）的概念，也就是上述DL公式中k＝6时的检出限。

       2.仪器检出限：用于评价仪器的检测能量，即：相对应背景，仪器可靠检测的最小信号，通常用信噪比S/N来表示，为S/N≥K,根据置信度概念，K可取2或3，为合理的赋予值。

       B: Sensitivity：灵敏度。对于灵敏度概念而言，在IUPAC的定义是：方法的灵敏度m表示被测组分浓度或含量改变一个单位时所引起的分析信号的变化，即m=dX/dc。其中X为分析信号，c为浓度或含量。在分析方法的校正曲线上，一般可以认为灵敏度就是分析校正曲线的斜率。曲线斜率越大，表示灵敏度越高。但在仪器参数中所说的“Sensitivity”并不是表示这一概念，而是具体指的是“DL（Detection Limit）或LOD（Limit Of Detection）”，比如BMG在Sensitivity的注解中就明确说明指的是“LOD”。如果上述（表中）参数描述的“Detection Limit”（Tecan/MD/PE）指的是“方法检出限”且“Sensitivity”(BMG/Bio-Tek/Thermo)指的是“LOD”时，则Sensitivity＝LOD＝DL＝Detection Limit。虽然描述词不同，但是概念是相同的，其参数可以直接比较。

       目前从各厂家官方公开的资料中，只有BMG明确说明采用国际理论与应用化学联合会（IUPAC）的检测标准去例明参数。也只有BMG公司在参数中明确写明了其Sensitivity的定义，包括定义、详细的测定条件等。例如在BMG最新推迟的高性能渐变滤片型光栅多功能酶标仪CLARIOstar的参数描述中，其FI（荧光）顶读的灵敏度为FI Filters (top) < 0.4 pM (< 8 amol/well Fluorescein, 384sv, 20 μL)，就在参数后面明确写明了测试灵敏度时的方法：采用荧光素（Fluorescein）为底物做6点的标准曲线，采用的是384 Small Volume微孔板，20μL的检测体系。这里要清楚知道，测定参数时采用的微孔板类型以及检测体系的体积非常重要。因为不同的条件，其灵敏度计算结果是不一样的。下面表2为各酶标仪厂家的官方网站的参数资料：

表2:

       从表2中可以看出，每个厂家都有不同的标准去定出其检测灵敏度。一般会把所用的检测浓度和质量写出来，但也有些厂家或型号只例出浓度单位，例如：Bio-Tek Neo，MD SpectraMax M5/M3等。要全面比较检测灵敏度，其实要配合浓度、质量和检测体积几个要数作考虑。如果只有浓度(M)，那实际检测的体积是多少?200μl?100μl或是20μl?不同的体积会使实际检测的质量不同，这可以是十倍或更多的差别。

       除此之外，统一性的检测标准也很重要。例如：BMG所有型号的顶读荧光每次都会用384 small volume微孔板，并以20μl的体积进行检测。从表2中可以看到由中端研究型的FLUOstar Omega到最高端的PHERAstar FS都是用统一的检测标准去量度和显示其灵敏度。如果型号间的检测标准不一，如Tecan入门型号F200和高端型号F500的参数，前者是用100μl做出的；后者是用10μl做出的。这样用户会发现一个有趣现象 – 就是单看浓度，F200（0.85pM）入门型好像比F500（1pM）高端型号更灵敏！当然用户也会有疑问，为什么较低端F200比高端的F500要多用10倍体积？大家同样是384孔板，为什么检测的体积标准不一样呢？那是否那100μl做出来的参数用20μl时可以做出同样的灵敏度(85 amol)？这相信值得用家去思考一下。

       BMG的所有参数是根据IUPAC标准去检测出来，所用的方法、体积、微孔板、浓度和质量等，都清楚例明。在384孔板中一贯采用20μl体积是因为这是最接近实际实验的情况。有些厂家所用的检测体积与现实情况其实有差距，例如Biotek的Synergy 2荧光参数标示为：“Fluorescein 1 pM typical (0.1 fmol/well 384-well plate) – Top”，虽然厂家没有写出来，但只要小心计算，可得出384孔板时的参数是用100μl的体积去做检测。实际上，市场上的384孔板的每孔体积一般只有约110μl (例如：CORNING)，而微孔板厂家推荐使用体积为20μl -80μl。如果用100μl去做检测是有点不太现实，因为体积太满会令孔内液体在检测移动过程中比较容易浅出，这也使孔板在实验过程中无法使用振动功能去摇匀孔内的样本，影响检测结果。再者，使用384孔板的原因除了因为高通量外，更重要的是想用更小的样本和试剂体积。如果在384孔板上要用到100μl的试剂样本，那跟原来想节省成本的原意就背道而驰了。当然，检测体积愈小，对仪器的检测灵敏度要求愈高，对厂家挑战也愈大。但BMG宁可放弃用较大体积做出来的漂亮参数，也要忠于实际操作，用小体积做出参数给客户参考。事实上，即使是BMG最入门的Optima系列的化学发光和荧光酶标仪，也被客户用来发表了超过110份Nature或Nature Publishing Group的文章，其优良的性能实际是不容怀疑。

       综合以上各方面，在对酶标仪的参数进行对比时，单位的统一非常重要，同时测定参数时采用的条件同样重要。对于众多厂家的仪器，其实很难用一个完全一样的方法去比较，因为不同厂家所用的条件都不一样。毕竟仪器的性能和表现是要用家使用出来，而不只是靠把参数写得漂亮。