前言
我们知道目前生命科学及现代分子生物学主要集中在对核酸和蛋白质等生物大分子的分析以及进行一些细胞水平的研究。传统的分析方法是采用放射性同位素作为一种示踪剂，标记在各种生物大分子或者细胞中来研究它们之间的相互作用和变化，但是放射性同位素对环境具有一定的破坏性，对人体健康也具有一定的损害，所以各国的科学家都致力于研究和应用高灵敏度的非同位素检测方法，利用荧光探针作为一种标记物，以其自身的一些优势而得到广泛的应用。目前对荧光进行检测的仪器种类很多，例如我们常见的荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、多功能读板仪（酶标仪）等，普通的荧光显微镜只能观察物质形态，不能给出量化指标，而流式细胞仪又因其价格昂贵和操作复杂不能得到广泛的应用。酶标仪作为一种荧光信号检测仪器，具有很多优势，不但价钱便宜、个头小、操作简便，而且还可以根据荧光信号特点和强弱来对物质进行定性和定量的分析。目前市面上支持荧光检测的多功能酶标仪种类很多，例如Molecular Devices的SpectraMax系列的M2，M3，M4和M5，和目前市面上唯一一款可以完成快速动力学实验的Flexstation 3等。
荧光产生机理
荧光探针（荧光染料分子）在光的照射下，物质的电子吸收能量后，可由低能级的电子层（内电子层）跳到高能级的电子层。此时，电子由低能态进入高能态。高能态的电子是不稳定的，他会在极短的时间（10-8s）内，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的能态。这时发射出的波长比激发光的波长要长，如果在可见光波长的范围内，为人眼所能看见的光，这种光称之为荧光。荧光是发光体分子中处于激发态的原子核外电子由高能级回到低能级所产生的辐射，因此是冷光。荧光的颜色多为蓝色、绿色、红色和黄色等。
荧光检测技术优势和影响因素
荧光检测技术具有灵敏度高、特异性好、动态范围宽、无放射性污染等优点；但也易受到反应体系中PH值和环境温度的影响，另外如荧光淬灭、光漂白等现象也会对荧光信号的检测产生较大的影响。
我们可以根据荧光探针分子特性（半衰期不同）将荧光检测技术分为荧光强度（FI）和时间分辨荧光（TRF）两大类。
荧光强度（FI）
荧光强度即发射荧光的光量子数，荧光强度决定了荧光色素检测的灵敏度。利用荧光强度进行物质定性：即不同的荧光物质有不同的激发光谱和发射光谱，因此可用荧光进行物质的鉴别。也可进行物质的定量测定：利用在较低浓度下荧光强度与样品浓度成正比这一关系可以定量分析样品中荧光组分的含量。荧光强度检测技术在生物学上的应用非常广泛，可以进行生物大分子定量、酶活性分析、荧光免疫分析、细胞学分析（细胞增殖、细胞毒理、细胞吸附等）、胞内钙离子浓度的变化、荧光蛋白的报道基因分析 (GFP)、细胞凋亡等。
细胞增殖检测
目前细胞增殖检测普遍采用MTT方法，其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，DMSO溶解后，酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，此法可间接反映活细胞数量。但是其步骤比较繁琐，且MTT对人有致癌性。所以荧光检测方法以其自身许多优点越来越得到大家青睐，以（Invitrogen）CyQuant细胞增殖检测试剂盒为例,其为一种绿色荧光探针，能与细胞裂解液中的核酸特异结合,其检测灵敏度可达50cell-50000cell/200ul，整个反应过程是免洗的，适合高通量实验，并且不易受到细胞培养液中血清等成分干扰。
细胞内钙流检测
钙离子是机体的重要元素，作为细胞内第二信使通过与钙调蛋白结合激活多种蛋白激酶（如腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶、钙调蛋白激酶等）及诸多蛋白水解酶和核酸酶，从而参与包括细胞代谢、细胞周期等多种细胞功能的调节，在细胞的许多生命活动中担当着重要的角色。传统的 Fura-2，indo-1，Quin-2是Ca2+荧光指示剂，可以反映细胞内钙离子浓度的变化，当结合钙离子时，最大激发波长会发生改变，发射荧光的强度和结合的Ca2+浓度有着定量的关系，但是这些钙流检测试剂有其自身一些缺点，首先整个反应过程需要水洗，不适合高通量实验要求，其二对温度敏感，光稳定性差。Molecular Devices针对于钙流检测特点推出了一系列检测试剂盒，首先采用专利的quanch技术，整个反应过程不需要水洗，增加检测通量，其次采用特殊的荧光探针，与钙离子结合后其稳定性较好，荧光信号强等优点得到很多实验者的肯定。
荧光蛋白报告基因分析
近几年在生命科学研究中，GFP（一种水母中提取的绿色荧光蛋白）作为一种报告基因以其自身的许多优点越来越受到大家重视，首先GFP无毒，自身在不需要辅酶作用下可以发光，且荧光信号稳定。我们可以用目的基因与GFP基因融合，转染细胞进行表达，通过荧光信号强弱来确定其表达量的高低。
时间分辨荧光（TRF）
时间分辨荧光（TRF）实际上是在荧光强度（FI）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外－可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度的提高了光学分析的灵敏度。但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过稀土元素（Eu、Tb、Sm、Dy)的三价离子的电子云的结构会一定程度上限制了电子的迁移，导致这类元素发生的荧光的衰减周期通常是很长，能达到1-2ms，可以满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。平时常用于时间分辨荧光检测的探针为Eu(铕）和Tb(铽）。时间分辨荧光检测技术具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽等优势，适用于生物学、医学免疫学的微量分析，如细胞因子检测、抗体检测、病毒抗原分析以及药物代谢分析等。
随着人们对食品安全的要求越来越高，国际社会上对食品中有毒有害物质的检测越来越严格，各种有毒有害物质的限量标准也在不断提高，时间分辨荧光免疫分析方法也可用于快速检测食品中的大肠杆菌O157:H7、赭曲霉毒素A 、微囊藻毒素和有害金属等。相信随着多功能酶标仪广泛的应用和各种检测试剂盒的不断开发，时间分辨免疫分析技术将在食品安全领域发挥更强大的作用。
荧光检测用酶标仪
综上所述，利用荧光探针作为检测手段具有很多优势，越来越多的基于其原理的检测试剂盒问世。如何能更好的提高其检测的灵敏度和线性范围，降低其背景值，提高信噪比呢？
优化检测结果的关键技术之一，酶标仪的核心部件单色器，主要作用是从波长范围宽广的光线中，分出波段较窄的单色光的装置。问世最早的是滤片型酶标仪，其配合二向色镜（其实也就是另一模式的滤光反光滤镜）等光路系统，可以满足大部分实验的需要。但是随着实验类型变化和检测需求不断提高，有时需要对激发和发射光谱进行研究，滤光片型酶标仪由于其滤片的数目限制，不能达到要求，故随之诞生了光栅型的仪器。第一台光栅型酶标仪是由Molecular Devices推出的，其在激发光和发射光处各有一个光栅，但是考虑到光纯度不够，所以在激发光栅和发射光栅的后面又加入了一组带阻滤光片，对杂光进行二次过滤，其结果基本与纯粹的滤光片系统一致。Molecular Devices的这项专利技术受到保护后，其它很多酶标仪厂家在光栅型酶标仪上面只能采用双光栅系统来提高光纯度，降低杂光率，即激发和发射各用了一组光栅，整个光路系统共四个光栅，所以也称四光栅型酶标仪，虽然也能提高其对杂光过滤，但是由于多了一组光栅作用后，其光强度损失较大，检测的灵敏度也会受到影响。
优化检测结果的关键技术之二，光源选择，不同的单色器对光的透射率不同，会影响检测灵敏度，那么光源本身强度高低也会对实验结果产生很大的影响，目前酶标仪比较普遍使用的光源分别为普通氙闪灯、高能氙闪灯和卤素灯等。LED灯作为一种新光源以其自身许多优势慢慢被许多酶标仪所采用，我们知道在同等效率下，LED灯寿命是传统卤素灯的10倍，免去了频繁的更换灯泡和等待灯泡预热所带来的麻烦，其光源能量强、稳定性好，所以有助于提高荧光检测的灵敏度。
传统酶标仪是采用光路系统和检测器系统一体式设计模式，模块出厂就已经固定，不可以进行功能上的升级。市场上需要一种用户可根据自己的要求进行随意升级的多功能酶标仪，Molecular Devices针对市场需求推出了一款名为Paradigm多功能酶标仪。它将光源系统和检测系统独立分开，多套检测器固定在主机上，针对不同实验要求选用不同的卡盒，每一种卡盒其实就是独立的光路系统，例如光吸收实验在波长灵活性上要求较高，那么针对这样的要求，光吸收卡盒采用光栅作为其单色器；针对于AlphaSreen 要求的特殊性，卡盒也采用了激光作为其光源，保证了实验数据的可靠性。
目前市场上唯一用户自己可升级酶标仪
用户升级所用时间 < 2 minutes
Tune卡盒的推出被认为是酶标仪发展技术上又一次划时代的突破，它是集荧光强度、化学发光、时间分辨荧光三功能为一体的卡盒。首先它采用了高能AUTO-LED灯作为其光源，不但增加检测灵敏度，而且还可以增加其检测线性范围，传统酶标仪针对不同强度的荧光信号采用在PMT（光电倍增管）进行调节，荧光强度检测线性范围一般在4至5个数量级，采用了AUTO-LED灯可以使检测动态范围增加至6至7个数量级。其次它将两种不同单色器的优势整合为一体，采用了一种全新的滤光片可调式技术，也就是既有光栅型单色器的灵活性（1nm光波可调），又保留了滤光片型单色器的光透率强的特点。这样荧光强度和时间分辨荧光检测实验上，既增加其检测的灵活性又增加检测的灵敏度，有数据表明Tune卡盒在荧光检测方面其灵敏度较光栅型单色器高10倍以上。
滤光片的灵敏度+光栅系统的波长可调 完美结合！
Molecular Devices一直以客户需求作为其研发重点，Paradigm多功能酶标仪和Tune多功能卡盒的推出就很好的证明了这一点，针对未来不同实验的不同要求，Molecular Devices将会推出针对其新检测方法的卡盒来更好的满足用户的需要。
