高通量药物筛选的含义及其在中国的发展趋势

　  

近年来，由于自动化技术特别是机器人的应用，在新药研究中出现了高通量筛选技术（High throughput screening, HTS），该技术将化学、基因组研究、生物信息，以及自动化仪器等先进技术，有机组合成一个高程序、高自动化的新模式，从而创造了发现新药的新程序。由于该技术具有快速、高效等特点，因而成为新药发现的主要手段。简而言之，高通量筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的一种新技术体系，它以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对数以千计的样品数据进行分析处理，从而得出科学准确的实验结果和特色效用。英国学者AlanD研究提示，一个实验室采用传统的方法，借助20余种药物作用靶位，1年内仅能筛选75000个样品；1997年高通量筛选技术发展初期，采用100余种靶位，每年可筛选100万个样品；1999年高通量筛选技术进一步完善后，每天的筛选量就高达10万种化合物。

 

高通量药物筛选主要由五个部分组成：
　　１．自动化操作系统 它主要是指计算机控制的实验室自动化工作站，又称实验室机器人。该工作站可以代替人工进行自动加样、稀释、转移、洗脱、混合、温孵、检测等操作，使实验遵守程序化，减少人工误差，结果更准确可靠。在国外，高通量自动化筛选系统主要由制药企业构建和使用。高通量自动化筛选系统建立以后，主要课题是如何保障不断需求的大量的筛选资源的问题。因此，发达国家的大型制药企业从企业竞争和自身发展的战略利益出发，纷纷建立高通量自动化的筛选系统，同时，投以巨资通过合作或共同研究等方式，谋求获得发展中国家的大量资源。
　　２．高灵敏度的检测系统   该系统是为了适应ＨＴＳ而出现的新检测仪器。由于ＨＴＳ在９６孔或更多孔的微板中进行实验，样品量小，因而要求仪器灵敏度高，而且能够对９６孔微板进行快速检测。现在用于ＨＴＳ的检测仪器已可以进行可见光、紫外光、荧光比色，也可以进行同位素放射活性测定和生物发光、化学发光等多方面的测定，使现有的体外实验方法多数可用于ＨＴＳ。

      2．1分光光度法   近年来，美、英两国研究人员在高通量筛选检测中，努力进行了光学测定方法的研究，建立了大量的非同位素标记测定法，如用分光光度检测法筛选蛋白酪氨酸激酶抑制剂、组织纤溶酶原激活剂等，均获得成功。为了适应高通量药物筛选，许多公司都生产了具备计算机接口并能对多孔板进行同时检测的分光光度计。以Molecular Device公司的Spectra 190为例，它采用8条光导纤维同时对8孔进行测定。测定波长以2nm为间隔，可以在190nm一850nm间进行选择。对未知物质，可在该范围内进行扫描以确定其特征吸收光谱。因此，大大增加了建立模型的多样性。检测数据以不同文件格式输出，可用随机软件或通用数据处理软件进行处理。方便、快速、准确、自动化程度高。分光光度法高灵敏仪器同自动化操作系统的连接，使得基于紫外、可见光谱的高通量药物筛选模型成为主要模型种类。
　　2．2 放射性检测技术  美国学者GanieSM在高通量药物筛选研究中，应用放射性测定法，特别是亲和闪烁（SPA）检测方法，使在96孔板上进行的样本量实验得到发展。该方法灵敏度高，特异性强，促进了高通量药物筛选的实现，但存在环境污染问题。
　　2．3荧光检测技术   美国学者GiulianokA研究认为，采用FLIPR(fluorometric imaging reader)荧光检测法（Molecular Devices），可在短时间内同时测定荧光或化学发光的强度和变化，对测定细胞内钙离子流及测定细胞内pH和细胞内钠离子流等，是一种非常理想的高效检测方法, 目前，FLIPR已成为业内公认的高通量药物筛选的黑马。现代药物筛选的速度与该项技术的发展和此仪器的更新紧密相关，是高通量药物筛选的必需设备。
　　2．4多功能微板检测系统：近年来多功能酶标仪技术取得突飞猛进的发展。其功能可涵盖光吸收、化学发光、荧光、荧光偏正、荧光能量共振转移和alpha screening 等方面，在药物筛选种得到广泛的应用。其检测体系可低至几微升样品量，通量可扩充到1536孔板。此项技术尤以Molecular Devices公司更为突出。Molecular Devices公司是专业的酶标仪技术开发和生产公司，其推出的酶标仪型号最全， 最经典。她的每一型号的酶标仪推出时，均为市场上的第一台， 始终引领着酶标仪的发展方向。 目前该公司正在研发下一代产品， 将来用户能在获得数据的同时，也可以看得到标本的图像。
　　３．分子、细胞水平的高特异性体外筛选模型 指用于检测药物作用的实验方法。由于ＨＴＳ要求反应总体积小，而且反应具有较高的特异性和敏感性，因此对于筛选模型也要求较高，常用的筛选模型都建立在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。目前这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反应方面。近年也出现了基因水平的药物筛选模型，使得药物筛选模型的范围更加广泛，特别是各种新的筛选模型随着生命科学基础研究的新成就不断应运而生，如端粒酶抑制、细胞凋亡诱导、细胞周期抑制、新生血管抑制等各种活性指标用作微生物活性成分的筛选模型。随着病理生理机制的不断阐明，人们更加注重基于作用机制的筛选模型。尤其是随着人类基因组计划的研究进展，建立基因芯片等针对某种基因为作用靶点的筛选模型和筛选方法也极受关注。此外，应用细胞模型或分子水平的模型　进行化合物毒理学和药物代谢药动力学的研究和筛选，在ＨＴＳ中也是十分重要的内容。通过分子细胞水平模型，进行毒理学和药物代谢动力学的筛选，是早期评价药物的体内过程非常重要的步骤，可以减少大量的动物实验药物开发的前期投入。在评价药物药理作用和发展前途方面有重要意义。
　　４．被筛样品管理库即样品库　 被筛样品管理库ＨＴＳ的重要特征之一是筛选样品的数量大。对大量样品进行筛选是发现新药的基础，国外进行药物筛选的机构都已储备了数以万计的化合物，建立了相当规模的样品库。样品库的建立，不仅需要大量化合物的储存，更重要的是建立合理、科学的管理系统。应用计算机进行样品库的管理，不仅可以使样品的应用程序化，而且可以对样品进行多方面的管理和分析，如查询样品、对样品进行编号、样品资料的查阅等。５．数据采集传输处理系统 该系统是ＨＴＳ的最后一道程序，主要由计算机完成。由于在ＨＴＳ中，每天可以产生大量数据，有时数千、数万甚至十余万或更多，虽然这些数据可以由检测系统自动进行采集和记录，但对其进行分析处理仍然是艰巨的工作。数据处理系统不仅能够对数据进行分析处理，而且可以根据要求，输出筛选报告。

　　5．其它辅助系统  除以上部分之外，尚有一些辅助系统配合ＨＴＳ，如计算机辅助设计、高效天然化合物提取方法等。用这些现代化方法进行药物筛选，真正实现了快速、大规模和一药多筛。另外，进行药物筛选有关的理论研究将提高药物筛选的目的性和有效性，并有可能提出新的研究方向。药物筛选的研究应包括药物筛选、药物发现规律和药物作用理论研究。进行理论研究重在及时总结已经获得的信息和资料，总结经验，修正已有的理论内容，建立新的药物筛选理论，如构效关系的普遍规律、受体理论、酶体理论等等。

 

我国进行药物高通量筛选的优势首先是化合物来源广泛，且多为天然；其次是对化合物生活活性的筛选目的较明确，无目的合成的化合物较少；第三，我国传统药物为筛选研究提供了一个巨大的资源库，可从中药中提取分离筛选新的化合物。这些优势为药物的高通量筛选打下了坚实基础。

　　我国药物高通量筛选初显规模药物高通量筛选工作在我国起步较晚，且不规范。近年来，高通量活性筛选技术的引入和迅速发展，极大的推动了创新药物的研究进程。高通量活性筛选的特点是能够进行大量样品的快速筛选，其基本要素包括足够大的样品库和优良的药理模型。与高通量活性筛选相应的样品的高通量制备和样品库以及新型药理模型的建立已成为目前创新药物研究的焦点。随着组合化学热点的降温，适合于高通量活性筛选的天然生物资源提取物、分离部位和单体化合物样品库的建立及相关方法的研究，已成为一些跨国制药企业、农业化学企业与天然产物研究机构合作和竞争的焦点。中草药是具有我国特色的创新药物的重要源泉，由于成分的复杂性，其提取物不宜直接用于高灵敏、微量的高通量活性筛选。但是，如果把平行和序列组合高通量分离技术用于中草药样品的分离，使复杂样品按极性快速分离成一些成分组(或单体)，不仅可以克服以上问题，而且能够使提取物中的微量成分得到富集，与高通量筛选相结合。经过高通量活性筛选得到的活性成分组(或单休)又可以与色谱一波谱联用技术结合，直接快速鉴定其中成分的结构或获取有价值的结构信息指导下一步研究。这样使中草药中创新药物先导物的发现与高通量活性筛选有机地结合，将极大地加快具有我国特色的以中草药有效物质为基础的创新药物研究步伐。

　高通量筛选技术，是目前药物筛选领域研究的重要课题，与传统的药物筛选方法相比有以下几个优点:反应体积小；自动化；灵敏快速检测；高度特异性。但是，高通量筛选作为药物筛选的方法,并不是一种万能的手段。首先，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，因此任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；其次，用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。但我们应该相信，任何技术的进步，都将为科学的发展起到促进作用。随着对高通量筛选研究的不断深入，随着对筛选模型的评价标准、新的药物作用靶点的发现以及筛选模型的新颖性和实用性的统一，高通量筛选技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。